自20世纪40年代起，人们都采用兔眼Draize试验评判化妆品原料及其成品的眼刺激。但动物试验在化妆品企业中开展难度、成本等相对较高，因此动物替代方法成为了企业内部的首选。

测试类型可分为四类，包括细胞（如3T3成纤维细胞，人原代角质形成细胞等）、离体器官（如牛角膜、猪角膜、兔眼球、鸡眼球等）、类器官（如鸡胚等）、人工组织方法（如重建角膜Epiocular、3D表皮模型等）。其中绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane，CAM）取样方便、容易，中胚层富含的血管网络很好地模拟了眼结膜结构，因此，是眼刺激性试验替代方法中广泛使用的模型之一。

目前使用CAM用于眼刺激测试的方法有三种：鸡胚绒毛尿囊膜试验（Hen’s egg test on the chorioallantoic membrane,HET-CAM）,鸡胚绒毛尿囊膜血管试验（Chorioallantoic membrane vascular assay, CAMVA）,鸡胚尿囊膜台盼蓝染色试验(the chorioallantoic membrane-trypan blue staining assay, TBS-CAM)。本文将针对以上三种动物替代试验展开介绍。

1. 鸡胚绒毛尿囊膜试验（HET-CAM）

HET-CAM最早于1985年由Luepke建立，随后国内外对于HET-CAM的研究及应用比较广泛，2009年中国质量监督检验检疫总局对于HET-CAM发布了检验检疫行业标准SN／T2329-2009，规范了HET-CAM的操作及评判标准。由于化学物对CAM的刺激反应多种多样，因此HET-CAM以出血、血管溶解、凝血作为观察终点，即在鸡胚发育第9天时神经组织和痛感还没形成的阶段，检测受试物导致CAM产生三种反应的严重程度。针对不同状态及剂型的化妆品或原料有不同的评价方法，对于透明液体受试物应采用反应时间法，记录反应过程中出现三种反应的时间点，从而计算样品的刺激性。对于膏体或混浊液体则采用终点评价法，在反应终点时对反应现象进行评价。反应时间法更强调的是血管效应出现的时间快慢，与样品最终造成的血管效应严重程度无关。终点评价法则更强调的是最终产生的的严重程度，过程中对血管效应产生的快慢无关。虽然在标准中记载的两种方法是针对不同剂型的方法处理，但建议筛选和比对配方、原料时，最好是采用同一种处理方法进行测试，对比性和参考性更强。

研究发现，HET-CAM可较好地检测表面活性剂以及以表面活性剂为基础的产品的刺激性，对于一些能对CAM进行着色的物质，HET-CAM不适用，且实验存在一定的主观性，实验员在操作时，应对血管现象了解、熟悉，避免出现误判。

2. 鸡胚尿囊膜台盼蓝染色试验(TBS-CAM)

在HET-CAM的基础上通过添加台盼蓝染色进行改进，可克服HET-CAM实验主观性强和损伤难量化的缺点。

台盼蓝是一种广泛用于区分存活细胞与死亡细胞的染料，常用于检测细胞膜的完整性和细胞的存活率。丧失活性或细胞膜不完整的细胞可被台盼蓝染成蓝色而正常的活细胞细胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，细胞不会被染成蓝色。TBS-CAM正是利用台盼蓝的这个特点，通过受试物与CAM接触后，损伤的CAM会吸收加入的台盼蓝，一定时间后剪下CAM，冲洗、干燥并称重，萃取后测量其萃取液吸光度值，通过计算单位膜重量吸收的台盼蓝的量（ISTB）作为检测终点，以此用来评判受试物的刺激性。TBS-CAM不受剂型的束缚，即染色原料或化妆品不影响检测结果的观察，解决了HET-CAM不能用于染色物质的测试的难题，亦能对损伤程度进行量化，减少人为地对刺激性进行评分，客观地对刺激进行评价。

3. 鸡胚绒毛尿囊膜血管试验（CAMVA）

CAMVA采用的是孵化至第10天的鸡胚，将化妆品原液或特定浓度下的化妆品原料滴加于聚四氟乙烯树脂环内，培养30min后观察环内血管效应-鬼影血管、充血以及不同程度出血并予以评分，最终计算其算术平均值即得到NC值。NC值则可以评判物质在某个特定浓度下的刺激性。CAMVA适用于评价化妆品或一定浓度下的原料的刺激性，与使用浓度相关，可测得不同浓度下物质的刺激性。与HET-CAM的终点评价法的共同点则是在于，CAMVA更强调的是通过样品致CAM最终的损伤严重程度进行评价。

综上所述，三种试验各有其优缺点（见表1），各在不同维度对刺激性进行评价，在化妆品配方及原料筛选时，可选用一种或者组合的形式对其进行评价，如HET-CAM与TBS-CAM试验的结合，可从血管效应产生的快慢以及对实验损伤程度的量化两个维度对受试物进行评价，也结合了主观与客观的评价，减少误差。

表1

这类试验材料方便易得，操作相对简单易行，设备及耗材成本相对较低，结果易于观察，在日化企业中搭建可行性较强。早期被美国机构替代方法管理小组，欧洲委员会，英国内务府，欧洲化妆品、盥洗用品和香水协会及日本、德国等广泛研究与评价。

在中国，这方面的研究也有一定的进展，报道显示此方法是比较有前途的替代方法。随着化妆品行业及消费者的安全性意识的提高，以及替代试验的研究及技术的越来越成熟，包括基于CAM开展的试验方法应用越来越广泛。